1. 背景 Fluoro-Gold的使用原理與其他熒光示蹤劑基本相同。主要區(qū)別在于，F(xiàn)luoro-Gold在注射后存活時(shí)間、濃度 范圍、組織處理方式以及與其他組織化學(xué)技術(shù)的兼容性方面更具靈活性。 

2. 儲(chǔ)存與保質(zhì)期 Dry Fluoro-Gold 應(yīng)儲(chǔ)存于避光、密封的容器中，溫度保持在 4 攝氏度。正確儲(chǔ)存條件下，Fluoro-Gold 的保質(zhì)期應(yīng)超過(guò)一 年。溶液中的染料亦應(yīng)儲(chǔ)存于避光、密封的容器中，溫度保持在 4 攝氏度；在此條件下，其穩(wěn)定性至少可維持六個(gè)月。 

3. 車輛 氟金可溶于蒸餾水或0.9%生理鹽水，亦可作為0.2M中性磷酸鹽緩沖液中的懸浮液使用。 

4. 染料濃度 氟金（Fluoro-Gold）已在1%-10%的濃度范圍內(nèi)成功應(yīng)用。初始推薦濃度為4%。若注射部位出現(xiàn)不良?jí)乃?反應(yīng)或標(biāo)記信號(hào)過(guò)強(qiáng)，應(yīng)將濃度降至2%溶液。如需進(jìn)行更精確的測(cè)量，需知氟金的分子量為532.6道爾頓。 

5. 染料給藥 A. 壓力注射——這可能是常用的給藥方式。注射體積范圍為0.05–1 µl ，通常為0.1–0.2 µl 。 B. 離子電滲療法——通過(guò)4-10秒的脈沖式離子電滲治療（電流強(qiáng)度為+5至+10微安/10分 鐘），可形成離散的小型注射點(diǎn)。 C. 晶體——示蹤劑晶體可通過(guò)微吸管尖部進(jìn)行給藥。 

6. 術(shù)后生存期 已觀察到良好的逆行標(biāo)記效果，其持續(xù)時(shí)間范圍從兩天至兩個(gè)月不等。典型的存活期為三至五天。較長(zhǎng)的 存活期可增強(qiáng)遠(yuǎn)端突起的染色填充效果，同時(shí)避免染料從細(xì)胞中擴(kuò)散。 

7. 固定；注視 幾乎任何固定劑均可使用，亦可不使用固定劑；通常采用含4%甲醛的磷酸鹽中性緩沖鹽水。含有高濃度重 金屬（如鋨、汞）的固定劑會(huì)淬滅熒光信號(hào)，而高濃度（超過(guò)1%）的戊二醛則可能增強(qiáng)背景熒光。 

8. 組織化學(xué)處理 含有熒光金的組織可采用幾乎所有常見(jiàn)的組織學(xué)技術(shù)進(jìn)行處理。這包括未固定的組織冷凍切片（10 µ m）、固定的組織冷凍切片（20 µm），以及從包埋于塑料（0.2–4 µm）或石蠟（3–10 µm）中的組織切 制的薄切片。其中，固定的組織冷凍切片最為常用。 

9. 組合方法 在這一處理階段，樣本切片可進(jìn)一步進(jìn)行第二種標(biāo)記技術(shù)處理，例如放射自顯影、 HRP 組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、 第二種熒光示蹤劑或熒光復(fù)染等。 

10. 安裝、清理和覆蓋 切片通常固定于明膠包被的載玻片上，經(jīng)空氣干燥后浸入二甲苯中，并用非熒光 DPX 塑料封片劑進(jìn)行封 片。除非與第二種示蹤劑不兼容，否則切片可采用梯度酒精進(jìn)行脫水處理。若需將熒光金技術(shù)與熒光免 疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)聯(lián)用，則切片經(jīng)空氣干燥后直接用中性緩沖甘油（1:2）進(jìn)行封片。 

11. 檢查與攝影 氟金可通過(guò)熒光顯微鏡并使用寬帶紫外激發(fā)濾光片進(jìn)行觀察。當(dāng)組織經(jīng)中性pH緩沖液處理后會(huì)發(fā)出金色熒光，而組織經(jīng)其 他處理時(shí)則會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光。該樣本采用酸性（例如pH 3.3）pH緩沖液進(jìn)行處理。可采用數(shù)字方式或膠片進(jìn)行拍攝（彩色打印使用Ektachrome 200-400 ASA膠片，黑白打印則使用同等感光度的膠片，例如Tri-X）。曝光時(shí)間通常為10至60秒， 具體取決于物鏡放大倍數(shù)和標(biāo)記物的強(qiáng)度；30秒的曝光時(shí)間約為平均值?？赏ㄟ^(guò)多次曝光同時(shí)觀察熒光金 與其他示蹤劑。因此，在放射自顯影技術(shù)中，可將紫外光與明場(chǎng)照明結(jié)合，同時(shí)定位熒光金與 HRP 或銀顆 粒；同樣，藍(lán)光激發(fā)可同時(shí)顯示FITC的綠色發(fā)射信號(hào)，而綠光激發(fā)則可用于同步觀察碘化丙啶或溴化乙錠 （一種熒光復(fù)染劑）的紅色發(fā)射信號(hào)。 

關(guān)于氟金應(yīng)用的補(bǔ)充信息 

車輛 對(duì)于通過(guò)微量注射器或微管進(jìn)行的壓力注射，氟金（Fluoro-Gold）應(yīng)溶解于蒸餾水中。 .9%生理鹽水。氟金也可作為懸浮液使用于0.2M中性磷酸鹽緩沖液中，但懸浮顆?？赡芏氯?xì)微量移液 管尖部，因此蒸餾水或0.9%生理鹽水是更優(yōu)選的載體。對(duì)于離子電滲療法，需將1%氟金溶液配制于0.1M 乙酸緩沖液（pH=3.3）中。經(jīng)過(guò)清洗（95% ETOH ，水）的玻璃微量移液管尖部直徑應(yīng)為10-20 µ m 。最佳離子電滲參數(shù)為：以脈沖電流（通電4-10秒，斷電4-10秒）施加+1至+5微安電流，持續(xù)時(shí)間 10-20分鐘。 

注射部位 幾乎任何中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)均可注射氟金（Fluoro-Gold）以用于逆行運(yùn)輸分析。在周圍神經(jīng)系統(tǒng) 中，可對(duì)神經(jīng)節(jié)及周圍靶點(diǎn)進(jìn)行研究。進(jìn)行周圍神經(jīng)研究時(shí)，需切斷或損傷神經(jīng)，并將其浸入或注射含5% 氟金水溶液。由于氟金不會(huì)被完整的傳導(dǎo)纖維顯著攝取，因此必須切斷或嚴(yán)重?fù)p傷纖維才能實(shí)現(xiàn)染料的攝 取。 

運(yùn)輸與存活時(shí)間 氟金（Fluoro-Gold）被用作逆行性軸突示蹤劑，盡管順行性軸突運(yùn)輸確實(shí)會(huì)發(fā)生。應(yīng)調(diào)整其存活時(shí)間（尤 其是縮短至12小時(shí)至2天），以在所研究的特定神經(jīng)元系統(tǒng)中順行性運(yùn)輸效率。對(duì)于逆行性運(yùn)輸，存 活時(shí)間應(yīng)調(diào)整為4天至14天。對(duì)于大多數(shù)系統(tǒng)而言，7至10天即可滿足需求；然而，較長(zhǎng)的神經(jīng)通路（例如 從脊髓到腦干）以及大型哺乳動(dòng)物（如貓、猴）的通路可能需要更長(zhǎng)的存活時(shí)間（例如14天）。此外，由 于氟金在逆行標(biāo)記的神經(jīng)元內(nèi)分布迅速，數(shù)月的存活時(shí)間同樣能獲得優(yōu)異效果。對(duì)于離子電滲法，推薦采 用2至5天的存活時(shí)間。據(jù)估計(jì)，哺乳動(dòng)物的運(yùn)輸速度約為每天2厘米；而冷血?jiǎng)游锏倪\(yùn)輸速度較慢。 

組織處理 組織處理方法在使用指南及原始出版物（Schmued and Fallon，1986，Brain Research 377:147-154）中均有 詳細(xì)說(shuō)明。由于熒光金在多種溶劑中均具有穩(wěn)定性，且在逆行標(biāo)記的神經(jīng)元內(nèi)保持快速分布特性，其應(yīng)用 兼容多種組織化學(xué)技術(shù)。該技術(shù)可與其他逆行追蹤劑、免疫熒光法、PAP與ABC免疫細(xì)胞化學(xué)法、 HRP 組織化學(xué)法、放射自顯影技術(shù)、復(fù)染法（選擇溴化乙錠作為熒光復(fù)染劑）、石蠟包埋及塑料包埋技術(shù)共同 使用。然而，若組織未經(jīng)固定，需在水性溶液中進(jìn)行超過(guò)一至兩小時(shí)的額外處理，會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記神經(jīng)元中的 熒光金熒光信號(hào)消失。熒光金在電子顯微鏡觀察中具有應(yīng)用價(jià)值；其亦可用于已切片并轉(zhuǎn)移至磷酸鹽緩沖 液中的腦組織樣本。切片通常固定于明膠包被的載玻片上，經(jīng)空氣干燥后浸入二甲苯中，并用 DPX 塑料 封片劑進(jìn)行封片。組織也可直接在載玻片上觀察而無(wú)需進(jìn)一步處理；也可通過(guò)梯度酒精進(jìn)行脫水處理；對(duì) 于免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，切片可經(jīng)空氣干燥后直接用中性緩沖甘油（1:2）進(jìn)行封片。 

檢查與攝影 熒光金需使用配備寬波段紫外（UV）激發(fā)濾光片的熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。應(yīng)采用與其他寬波段紫外激發(fā)的 熒光逆行示蹤劑（如True Blue、Fast Blue、Nuclear Yellow）相同的濾光片組，例如Leitz Phloem濾光系統(tǒng)A （寬波段UV，激發(fā)濾光片BP 340-380）、Mirror RKP 400、Barrier Filter LP 430）。載物臺(tái)應(yīng)專門用于熒光 顯微鏡（如蔡司品牌產(chǎn)品），材質(zhì)可選用甘油或水。由于塑料會(huì)吸收紫外光，不建議通過(guò)塑料培養(yǎng)皿等介 質(zhì)觀察樣本。推薦使用的膠片為T-Max（柯達(dá)，黑白）和Ektachrome 200（柯達(dá)，彩色）。曝光時(shí)間通常為 20秒至1.5分鐘