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1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的三種測(cè)定方法，即液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[包括氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS），氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（GC-MS/MS）]。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量測(cè)定；液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜（包括氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜）法同時(shí)適用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定性確證。
本標(biāo)準(zhǔn)液相色譜法的定量限為2 mg/kg，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法的定量限為0.01 mg/kg，氣相色譜-質(zhì)譜法的定量限為0.05 mg/kg（其中氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法的定量限為0.005 mg/kg）。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的版本。凡是不注日期的引用文件，其版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法
3 *法液相色譜法（HPLC）
3.1 原理
試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，經(jīng)陽(yáng)離子交換固相萃取柱凈化后，用液相色譜測(cè)定，外標(biāo)法定量。
3.2 試劑與材料
除非另有說(shuō)明，所有試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。
3.2.1甲醇：色譜純。
3.2.2乙腈：色譜純。
3.2.3氨水：含量為25％～28％。
3.2.4三氯乙酸。
3.2.5檸檬酸。
3.2.6辛烷磺酸鈉：色譜純。
3.2.7甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取50 mL 甲醇和50 mL 水，混勻后備用。
3.2.8三氯乙酸溶液（1％）：準(zhǔn)確稱取10 g三氯乙酸于1 L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻后備用。
3.2.9氨化甲醇溶液（5％）：準(zhǔn)確量取5 mL 氨水和95 mL 甲醇，混勻后備用。
3.2.10離子對(duì)試劑緩沖液：準(zhǔn)確稱取2.10 g檸檬酸和2.16 g辛烷磺酸鈉，加入約980 mL 水溶解，調(diào)節(jié)pH 至3.0 后，定容至1L備用。
3.2.11三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：CAS 108-78-01，純度大于99.0%。
3.2.12三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取100 mg（到0.1 mg）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中，用甲醇水溶液（3.2.7）溶解并定容至刻度，配制成濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃避光保存。
3.2.13陽(yáng)離子交換固相萃取柱：混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱，基質(zhì)為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg，3 mL，或相當(dāng)者。使用前依次用3 mL 甲醇、5 mL 水活化。
3.2.14定性濾紙。
3.2.15海砂：化學(xué)純，粒度0.65 mm～0.85 mm，二氧化硅（SiO2）含量為99％。
3.2.16微孔濾膜：0.2 μm，有機(jī)相。
3.2.17氮?dú)猓杭兌却笥诘扔?/span>99.999％。
3.3 儀器和設(shè)備
3.3.1液相色譜（HPLC）儀：配有紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。
3.3.2分析天平：感量為0.0001 g和0.01 g。
3.3.3離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于4000 r/min。
3.3.4超聲波水浴。
3.3.5固相萃取裝置。
3.3.6氮?dú)獯蹈蓛x。
3.3.7渦旋混合器。
3.3.8具塞塑料離心管：50 mL。
3.3.9研缽。
3.4 樣品處理
3.4.1提取
3.4.1.1 液態(tài)奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等，稱取2 g（至0.01 g）試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液（3.2.8）和5 mL乙腈，超聲提取10 min，再振蕩提取10 min后，以不低于4000 r/min離心10 min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤(rùn)濕的濾紙過(guò)濾后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL濾液，加入5 mL水混勻后做待凈化液。
3.4.1.2 奶酪、奶油和巧克力等稱取2 g（至0.01 g）試樣于研缽中，加入適量海砂（試樣質(zhì)量的4倍～6倍）研磨成干粉狀，轉(zhuǎn)移至50 mL具塞塑料離心管中，用15 mL三氯乙酸溶液（3.2.8）分?jǐn)?shù)次清洗研缽，清洗液轉(zhuǎn)入離心管中，
再往離心管中加入5 mL乙腈，余下操作同3.4.1.1中“超聲提取10 min，……加入5 mL水混勻后做待凈化液”。
注：若樣品中脂肪含量較高，可以用三氯乙酸溶液飽和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱凈化。
3.4.2凈化
將3.4.1中的待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱（3.2.13）中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液（3.2.9）洗脫。整個(gè)固相萃取過(guò)程流速不超過(guò)1 mL/min。洗脫液于50℃下用氮?dú)獯蹈?，殘留物（相?dāng)于0.4 g樣品）用1 mL流動(dòng)相定容，渦旋混合1 min，過(guò)微孔濾膜（3.2.16）后，供HPLC測(cè)定。3.5 液相色譜測(cè)定
3.5.1 HPLC 參考條件
a） 色譜柱：C8柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當(dāng)者；
C18柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當(dāng)者。
b） 流動(dòng)相：C8柱，離子對(duì)試劑緩沖液（3.2.10）-乙腈（85+15，體積比），混勻。
C18柱，離子對(duì)試劑緩沖液（3.2.10）-乙腈（90+10，體積比），混勻。
c） 流速：1.0 mL/min。
d） 柱溫：40℃。
e） 波長(zhǎng)：240 nm。
f） 進(jìn)樣量：20 μL。
3.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
用流動(dòng)相將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到的濃度為0.8、2、20、40、80 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度由低到高進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程?；|(zhì)匹配加標(biāo)三聚氰胺的樣品HPLC 色譜圖參見(jiàn)附錄A 中的圖A.1。
3.5.3定量測(cè)定
待測(cè)樣液中三聚氰胺的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過(guò)線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)樣分析。
3.5.4結(jié)果計(jì)算
試樣中三聚氰胺的含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按式（1）計(jì)算獲得：
A × c × V×1000
X=f × ……………………（1）
As × m×1000
式中：
X —— 試樣中三聚氰胺的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；
A —— 樣液中三聚氰胺的峰面積；
c —— 標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；
V —— 樣液zui終定容體積，單位為毫升（mL）；
As —— 標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的峰面積；
m —— 試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；
f —— 稀釋倍數(shù)。
3.6 空白實(shí)驗(yàn)
除不稱取樣品外，均按上述測(cè)定條件和步驟進(jìn)行。
3.7 方法定量限
本方法的定量限為2 mg/kg。
3.8 回收率
在添加濃度2 mg/kg～10 mg/kg濃度范圍內(nèi)，回收率在80%～110%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。
3.9 允許差
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。