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本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)的藥物殘留檢測產(chǎn)品,與儀器分析技術(shù)比較，能經(jīng)濟(jì)、快速地檢測出肌肉組織、飼料、尿液等樣品中的萊克多巴胺含量。

三、交叉反應(yīng)率

與類似物的交叉反應(yīng)率：

萊克多巴胺…………………………………100%

沙丁安醇……………………………………﹤1%

鹽酸多巴安………………………………﹤1%

克倫特羅 ………………………………﹤1%

四、試劑盒組成

酶標(biāo)板1塊，96孔/板

標(biāo)準(zhǔn)液5瓶（1 mL/瓶）：

0 ppb、0. 1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb

酶標(biāo)記物  ………………………………………7mL

抗體工作液 ………………………………………10mL

底物液A ………………………………………7mL

底物液B………………………………………7mL

終止液……………………..…………………7mL

10×濃縮洗滌液………………………………40mL

2×濃縮復(fù)溶液………………………………50mL

說明書……………………..………………1份

五、使用單位需自備的設(shè)備及試劑

（1）儀器

微孔板酶標(biāo)儀(450 nm)；氮?dú)獯蹈裳b置；振蕩器；離心機(jī)；渦旋儀；電子天平（感量0.01 g）。

（2）器材

容量瓶：100 mL，500 mL，1000 mL

單道微量移液器：20 μL～200 μL，100 μL~1000 μL

多道微量移液器：30 μL～300 μL

（3）試劑

甲醇、乙腈、正己烷、*、濃鹽酸、去離子水

六、溶液的配制

樣本前處理需配制：

配液1：1M  NaOH溶液

        稱取4.0 g NaOH加去離子水溶解，定容至100 mL。

配液2：0.1M  HCl  

量取0.83 mL濃鹽酸加入去離子水中定容至100 mL。

配液3：25%甲醇

       量取25mL甲醇，加入到75mL去離子水中，充分混勻。

配液4：25%甲醇-0.1MHCL溶液

量取20mL 0.1M 鹽酸溶液加入到80mL 25%甲醇溶液中并充分混勻。     

配液5：樣本復(fù)溶液

2×濃縮復(fù)溶液在使用前請按1：1稀釋（1份濃縮樣本復(fù)溶液+ 1份去離子水）。

配液6：洗滌工作液

10×濃縮洗滌液在使用前請按1：9稀釋（1份濃縮洗滌液 + 9份去離子水）（可按需配置）。

七、樣本前處理方法

樣本處理前須知：

（1）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。

    （2）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必須使用潔凈實(shí)驗(yàn)器具，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

樣本前處理步驟：

（A）組 織處理（雞、鴨、豬肌肉/肝臟、雞蛋、魚、蝦等）

處理方法一：

1、準(zhǔn)確稱取2.0±0.02 g勻漿樣本于50 mL離心管中；

2、加入0.5mL稀釋后的樣本復(fù)溶液（配液5），充分振蕩2min，加入8mL 乙腈，充分渦旋振蕩3~5 min，室溫4000 r/min離心10 min；

3、取2.5 mL上層液體至另一離心管中，50~60℃氮?dú)獯蹈桑?/span>

4、加入1 mL 正己烷溶解殘余物，再加入1mL樣本復(fù)溶液（配液5），充分混合30 s，室溫4000 r/min離心10 min；

5、去除上層正己烷，取20 μL下層液用于分析。

處理方法二：

1、準(zhǔn)確稱取2.0±0.02 g勻漿樣本于50 mL離心管中；

2、加入6mL25%甲醇-0.1MHCL溶液，振蕩混勻3~5min，室溫4000 r/min以上離心10 min（注：若組織樣本中油脂含量較高，可在振蕩后放入85℃水浴10min后再離心）；

3、取1 mL上層液體至另一2mL離心管中，加入20μL 1M*溶液并充分混勻（混勻以后測定pH值，大約為7-8）；

4、 4000 r/min離心3~5 min；取上清液20 μL用于分析。

（B）尿液、血清

     取20 μL清亮尿樣或血清直接測定（如尿樣或血清渾濁

     必須通過過濾或4000 r/min于15℃離心10 min 直至清

     亮），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。

八、酶聯(lián)免疫檢測步驟

測定前須知：

1、 使用之前將所有試劑和需用微孔板回升至室溫。

2、 使用之后立即將所有試劑放回2~8 ℃。

3、 在使用中不要讓微孔干燥。 

4、 在ELISA分析中的重復(fù)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。

5、 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

測定步驟：

1、 將所需試劑和微孔板從冷藏環(huán)境中取出，在室溫下平衡30 min，每種液體使用前均須搖勻。注意標(biāo)準(zhǔn)液均需做2個(gè)平行試驗(yàn)。

2、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品20 μL/孔，加入酶標(biāo)記物50 μL/孔，再加入抗體工作液80 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋好，室溫25℃下避光反應(yīng)30 min。

3、 洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加洗滌液 250 μL/孔，每次浸泡15~30 s，充分洗滌4~5次，用吸水紙拍干。

4、 顯色：每孔先各加入底物液A 50 μL，再各加入底物液B 50 μL，輕輕振蕩混勻，并在室溫25℃下避光反應(yīng)10~15 min。

5、 測定：每孔各加50 μL終止液，輕輕振蕩混勻在酶標(biāo)儀于450 nm處測定OD值（建議用450/630 nm雙波長檢測，在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）。

九、結(jié)果分析

        所測得的標(biāo)準(zhǔn)液或樣品吸光度的平均值（B）除以第 

     一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0標(biāo)準(zhǔn)液）的吸光度（B₀）值再乘以100%，

     得到百分吸光度值。

百分吸光度值（%）＝

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的10為底的對數(shù)為X軸， 百分吸光值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣本的百分吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的值，作為10的冪，乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中所含萊克多巴胺的量。

利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。

十、樣本稀釋倍數(shù)

動物組織：2倍（方法一）、4倍（方法二）

尿液、血清樣品：1倍

十一、試劑盒靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度

試劑盒靈敏度：0. 1ppb

樣本檢測限：

組織樣品（方法一）…………………0.2ppb

組織樣品（方法二）…………………0.4 ppb

尿液、血清樣品………………………0.1ppb

回收率：

組織樣品 …………………………75±20%

     尿液、血清樣品………………………95±20%

精密度：試劑盒的變異系數(shù)均小于10%

十二、注意事項(xiàng)

1、室溫低于20 ℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20~25 ℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象，所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

4、保存試劑盒于2~8 ℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

5、顯色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。

6、在加入底物液后，一般顯色15 min即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時(shí)間到20 min（或更長），但不得超過30 min；反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。

十三、貯藏條件及保存期

貯藏條件：在2~8 ℃保存試劑盒。

保存期：本試劑盒有效期為12個(gè)月。